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partie-1/resultats : modifications selon les commentaires de D. Housset

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......@@ -12,9 +12,14 @@ dissociation (K~D~), sans marquage (contrairement aux méthodes de mesure de
polarisation ou d'anisotropie de fluorescence) ni immobilisation d'un des
partenaires (contrairement à la résonance plasmonique de surface) ni séparation
(contrairement aux techniques de centrifugation, de chromatographie et
d'électrophorèse). Le calorimètre est schématisé dans la figure suivante :
d'électrophorèse). Cette technique en solution nous apparaît pertinente pour
l'étude de protéines solubles telles que TRF2 et RAP1 en absence d'ADN.
Remarquons que la résonance plasmonique de surface (SPR) serait bien adaptée
à l'étude des interactions entre protéines télomériques en présence d'ADN,
puisqu'un ADN immobilisé permettrait de mimer le télomère. Le calorimètre est
schématisé dans la figure suivante :
![Figure : Représentation schématique d'un calorimètre de titration isotherme (domaine public : <https://en.wikipedia.org/wiki/File:ITC1.png>).](partie-1/figures/calorimetre.png)
![Figure : Représentation schématique d'un calorimètre de titration isotherme (domaine public : <https://en.wikipedia.org/wiki/File:ITC1.png>)](partie-1/figures/calorimetre.png)
Une des deux molécules est placée dans la cuve et l'autre dans la seringue.
Les concentrations doivent être de l'ordre de 10x K~D~ dans la cuve et 100x K~D~
......@@ -40,14 +45,15 @@ de départ sont bien choisies, le tracé de la variation d'enthalpie en fonction
du rapport molaire à chaque point d'injection donne une courbe sigmoïde qui
permet d'obtenir par ajustement d'un modèle mathématique les valeurs de K~A~ (la
constante d'équilibre d'association ; K~A~ = 1 / K~D~) et n (la stoechiométrie)
associées à l'interaction. La variation d'enthalpie libre associée
à l'interaction (ΔG) peut être calculée avec l'équation ΔG = - RT ln(K~A~) où
R est la constante des gaz parfaits et T la température. Finalement, la
variation d'entropie (ΔS) est calculée à partir de la relation ΔG = ΔH - TΔS.
La titration calorimétrique est la seule technique à ce jour qui puisse fournir
tous ces paramètres thermodynamiques en une expérience. D'autre part, cette
technique en solution nous apparaît pertinente pour l'étude de protéines
solubles telles que TRF2 et RAP1.
associées à l'interaction. La valeur de KA correspond au coefficient directeur
de la tangente au point d'inflexion, tandis que la stoechiométrie correspond au
rapport molaire auquel le point d'inflexion apparaît. La variation d'enthalpie
libre associée à l'interaction (ΔG) peut être calculée avec l'équation ΔG = - RT
ln(K~A~) où R est la constante des gaz parfaits (R = 1,987 cal.K^-1^.mol^-1^) et
T la température. Finalement, la variation d'entropie (ΔS) est calculée à partir
de la relation ΔG = ΔH - TΔS. La titration calorimétrique est la seule technique
à ce jour qui puisse fournir tous ces paramètres thermodynamiques en une
expérience, et donc de caractériser en détails des interactions complexes.
Dans nos conditions expérimentales (cf. Matériel et méthodes), la titration
calorimétrique de TRF2 par RAP1 produit de façon reproductible une courbe à deux
......@@ -56,7 +62,7 @@ C-terminal isolé de RAP1 (RAP1-RCT) nous n'observons que la transition majeure
dans la courbe de titration (figure suivante), en accord avec les données déjà
disponibles dans la littérature [@chen2011; @janoukova2015].
![Figure : Titration calorimétrique de TRF2 par RAP1 (panneau de gauche) et par RAP1-RCT (panneau de droite).](partie-1/figures/itc-t2-r1-rct.png)
![Figure : Titration calorimétrique de TRF2 par RAP1 (panneau de gauche) et par RAP1-RCT (panneau de droite)](partie-1/figures/itc-t2-r1-rct.png)
La comparaison des différents paramètres thermodynamiques de ces interactions
(tableau suivant) nous permet de confirmer que la transition majeure correspond
......@@ -83,9 +89,9 @@ TRF2/RAP1-RCT et TRF2/RAP1 (a : transition majeure ; b : transition mineure).
Nous obtenons les K~D~ suivants :
- TRF2/RAP1-RCT : K~D~ ≃ 1 nM (la valeur est approximative car il y a peu de
- TRF2/RAP1-RCT : K~D~ ≃ 0,5 nM (la valeur est approximative car il y a peu de
points dans la région d'inflexion de la sigmoïde),
- TRF2/RAP1 : K~D~ ≃ 1 nM pour la transition majeure, et K~D~ ≃ 0,5 μM pour la
- TRF2/RAP1 : K~D~ ≃ 0,5 nM pour la transition majeure, et K~D~ ≃ 0,5 μM pour la
transition mineure (la valeur est approximative car la transition mineure est
en partie masquée par la transition majeure).
......@@ -268,7 +274,9 @@ basée sur l'approximation que les particules diffusant les rayons X sont
globulaires [elle tend à sous-estimer le R~g~ pour des protéines flexibles, voir
@receveur-brechot2012].
Table: Tableau : R~g~, D~max~ et masses moléculaires des protéines et des complexes (nd : non déterminé).
Table: Tableau : R~g~, D~max~ et masses moléculaires des protéines et des
complexes (nd : non déterminé ; les valeurs de R~g~ et D~max~ sont obtenues par
la fonction de distribution des distances)
**Protéine ou complexe** **Masse moléculaire théorique (kDa)** **Masse moléculaire expérimentale (kDa)** **R~g~ (Å)** **D~max~ (Å)**
-------------------------- --------------------------------------- ------------------------------------------- -------------- ----------------
......@@ -302,17 +310,17 @@ détecter des changements de conformation globaux et qui se produisent pour
l'ensemble des molécules présentes dans l'échantillon.
En comparant les enveloppes superposées de TRF2 et du complexe TRF2/RAP1 (figure
ci-dessus, G), nous pouvons observer que la présence de RAP1 semble étendre
encore plus la conformation de TRF2, comme l'indique une plus grande valeur de
D~max~ pour le complexe TRF2/RAP1 comparé à TRF2 seul. Au contraire, la
conformation du complexe TRF2/RAP1-RCT n'est pas significativement différente de
celle de TRF2 seul, comme en témoignent les valeurs de R~g~ et D~max~
relativement proches (voir aussi la figure ci-dessus, F). Enfin, de façon
particulièrement intéressante, la comparaison de ces enveloppes révèle que
celles de TRF2 et RAP1 ne peuvent pas se superposer à celle du complexe
TRF2/RAP1 (figure ci-dessus, H : un exemple parmi tous nos essais), ce qui
indique que la formation du complexe fait intervenir un changement de
conformation majeur des deux protéines.
ci-dessus, G), nous pouvons observer que le complexe TRF2/RAP1 est plus étendu
que TRF2 seule, comme l'indique une plus grande valeur de D~max~ pour le
complexe TRF2/RAP1 comparé à TRF2 seule. Au contraire, la conformation du
complexe TRF2/RAP1-RCT n'est pas significativement différente de celle de TRF2
seule, comme en témoignent les valeurs de R~g~ et D~max~ relativement proches
(voir aussi la figure ci-dessus, F). Enfin, de façon particulièrement
intéressante, la comparaison de ces enveloppes révèle que celles de TRF2 et RAP1
ne peuvent pas se superposer à celle du complexe TRF2/RAP1 (figure ci-dessus,
H : un exemple parmi tous nos essais), ce qui indique que la formation du
complexe fait intervenir un changement de conformation majeur des
deux protéines.
### L'interaction entre TRF2 et RAP1 implique un motif TBM
......@@ -366,11 +374,12 @@ RAP1-ARAGA. Nous avons mesuré l'interaction de ce mutant avec TRF2 par ITC
![Figure : Titration calorimétrique de TRF2 par RAP1-ARAGA.](partie-1/figures/itc-trf2-araga.png)
Comme attendu, nous retrouvons la transition majeure correspondant
à l'interaction de haute affinité entre le domaine RCT de RAP1 et TRF2.
Sans être totalement abolie, la transition mineure est nettement réduite, et il
n'est plus possible de calculer le K~D~ correspondant. Ceci démontre que le
motif TBM de RAP1 participe bien à l'interaction complète avec TRF2, même si le
signal résiduel suggère que la surface d'interaction est plus étendue.
à l'interaction de haute affinité (K~D~ ≃ 0,5 nM) entre le domaine RCT de RAP1
et TRF2. Sans être totalement abolie, la transition mineure est nettement
réduite, et il n'est plus possible de calculer le K~D~ correspondant.
Ceci démontre que le motif TBM de RAP1 participe bien à l'interaction complète
avec TRF2, même si le signal résiduel suggère que la surface d'interaction est
plus étendue.
### Les surfaces d'interaction entre TRF2 et RAP1 ne sont pas limitées au motif TBM
......
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