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resultats/chap3 : partie cristallo

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# Cristallogenèse
Toutes les expériences de cristallogenèse sont réalisées par la méthode de
diffusion de vapeur. Les premiers essais de cristallisation sont réalisés par
des cribles de 7x 96 conditions en gouttes assises de 0,2 μL préparées par un
robot Mosquito à la plateforme de cristallogenèse de l'Institut Pasteur (Paris).
Lorsque des conditions favorables sont trouvées dans ces cribles, elles sont
reproduites manuellement au laboratoire en gouttes suspendues de 1 μL dans des
plaques de 24 puits.
Les 2x 48 conditions décrites dans [@pryor2012; @lebihan2013] ont été préparées
à l'aide du robot pipeteur MatrixMaker de la plateforme de cristallogenèse de
l'Institut Pasteur.
# Collecte et traitement des données de diffraction
Toutes les expériences de diffraction des rayons X ont été faites au synchrotron
SOLEIL, sur les lignes de lumière PROXIMA 1 et 2. Les images de diffraction ont
été indexées et intégrées à l'aide du logiciel XDS [@kabsch2010].
......@@ -532,6 +532,20 @@ The termini of linear chromosomes are protected by specialized {DNA} structures
keywords = {citation-these, Crystallization, Protein - {DNA}}
},
@article{hollis2007,
title = {Crystallization of {protein-DNA} complexes},
volume = {363},
issn = {1064-3745},
doi = {10.1007/978-1-59745-209-0_11},
abstract = {Determining the crystal structure of a {protein-DNA} complex can provide a wealth of information regarding protein function and mechanism. The foundation for all successful X-ray structure determination is the ability to produce diffraction-quality crystals. Crystallization of {protein-DNA} complexes often presents unique challenges because of the additional parameters involved. This chapter will outline many of those challenges, including choice of {DNA} and formation of a stable {protein-DNA} complex and provide guidance in preparing for crystallization experiments. Additionally, techniques for oligonucleotide purification, sample preparation, and crystallization methods are provided. Careful thought and initial analysis of the {protein-DNA} complex prior to crystallization experiments followed by optimization of crystallization parameters can greatly increase the likelihood of producing well-diffracting crystals.},
journal = {Methods in molecular biology {(Clifton}, {N.J.)}},
author = {Hollis, Thomas},
year = {2007},
note = {{PMID:} 17272844},
keywords = {citation-these, Crystallization, Protein - {DNA}},
pages = {225--237}
},
@article{houghtaling2004,
title = {A dynamic molecular link between the telomere length regulator {TRF1} and the chromosome end protector {TRF2}},
volume = {14},
......@@ -594,6 +608,22 @@ Our findings suggest a dynamic cross talk between {TRF1} and {TRF2} and provide
pages = {99--107}
},
@article{kabsch2010,
title = {{XDS}},
volume = {66},
issn = {0907-4449},
url = {http://scripts.iucr.org/cgi-bin/paper?S0907444909047337},
doi = {10.1107/S0907444909047337},
number = {2},
journal = {Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography},
author = {Kabsch, Wolfgang},
month = feb,
year = {2010},
note = {00000},
keywords = {citation-these, Crystallography, Data processing, Software},
pages = {125--132}
},
@article{kim1999,
title = {{TIN2}, a new regulator of telomere length in human cells},
volume = {23},
......@@ -684,6 +714,22 @@ Our findings suggest a dynamic cross talk between {TRF1} and {TRF2} and provide
pages = {15988--15993}
},
@article{lebihan2013,
title = {Effect of Rap1 binding on {DNA} distortion and potassium permanganate hypersensitivity},
volume = {69},
issn = {1399-0047},
doi = {10.1107/S0907444912049311},
abstract = {Repressor activator protein 1 {(Rap1)} is an essential factor involved in transcription and telomere stability in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Its interaction with {DNA} causes hypersensitivity to potassium permanganate, suggesting local {DNA} melting and/or distortion. In this study, various {Rap1-DNA} crystal forms were obtained using specifically designed crystal screens. Analysis of the {DNA} conformation showed that its distortion was not sufficient to explain the permanganate reactivity. However, anomalous data collected at the Mn edge using a {Rap1-DNA} crystal soaked in potassium permanganate solution indicated that the {DNA} conformation in the crystal was compatible with interaction with permanganate ions. Sequence-conservation analysis revealed that {double-Myb-containing} Rap1 proteins all carry a fully conserved Arg580 at a position that may favour interaction with permanganate ions, although it is not involved in the hypersensitive cytosine distortion. Permanganate reactivity assays with wild-type Rap1 and the {Rap1[R580A]} mutant demonstrated that Arg580 is essential for hypersensitivity. {AFM} experiments showed that wild-type Rap1 and the {Rap1[R580A]} mutant interact with {DNA} over 16 successive binding sites, leading to local {DNA} stiffening but not to accumulation of the observed local distortion. Therefore, Rap1 may cause permanganate hypersensitivity of {DNA} by forming a pocket between the reactive cytosine and Arg580, driving the permanganate ion towards the {C5-C6} bond of the cytosine.},
number = {Pt 3},
journal = {Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography},
author = {Le Bihan, Yann Va\"{i} and Matot, B\'{e}atrice and Pietrement, Olivier and {Giraud-Panis}, Marie Jos\`{e}phe and Gasparini, Sylvaine and Le Cam, Eric and Gilson, Eric and Sclavi, Bianca and Miron, Simona and Le Du, Marie H\'{e}l\`{e}ne},
month = mar,
year = {2013},
note = {{PMID:} 23519416},
keywords = {{AFM}, Biochemistry, citation-these, Crystallization, Crystallography, {DNA} footprinting, Protein - {DNA}, Rap1, S. cerevisiae, Screen, Telomeres},
pages = {409--419}
},
@article{li2000,
title = {Identification of human Rap1: implications for telomere evolution},
volume = {101},
......@@ -903,6 +949,23 @@ Our findings suggest a dynamic cross talk between {TRF1} and {TRF2} and provide
pages = {2566--2576}
},
@article{pryor2012,
title = {Crystallization of Pseudomonas aeruginosa {AmrZ} protein: development of a comprehensive method for obtaining and optimization of {protein-DNA} crystals},
volume = {68},
issn = {1744-3091},
shorttitle = {Crystallization of Pseudomonas aeruginosa {AmrZ} protein},
doi = {10.1107/S1744309112025316},
abstract = {The {AmrZ} protein from the pathogenic bacterium Pseudomonas aeruginosa is a transcription factor that activates and represses the genes for several potent virulence factors, which gives the bacteria a selective advantage in infection. {AmrZ} was crystallized in complex with {DNA} containing the {amrZ1} repressor binding site. Obtaining crystals of the complex required the integration of a number of well known techniques along with the development of new methods. Here, these processes are organized and combined into a comprehensive method which yielded diffraction-quality crystals. Part of this method included thorough data mining of the crystallization conditions of {protein-DNA} complexes to create a new directed crystallization screen. An optimized technique for the verification of {protein-DNA} complexes in crystals is also presented. Taken together, the methods described in this article attempt to streamline the difficult process of obtaining diffraction-quality crystals of {protein-DNA} complexes through the organization of older methods combined with the introduction of new techniques.},
number = {Pt 8},
journal = {Acta crystallographica. Section F, Structural biology and crystallization communications},
author = {Pryor, Edward E, Jr and Wozniak, Daniel J and Hollis, Thomas},
month = aug,
year = {2012},
note = {{PMID:} 22869139},
keywords = {citation-these, Crystallization, Protein - {DNA}, Screen},
pages = {985--993}
},
@article{raffa2013,
title = {Organization and Evolution of Drosophila Terminin: Similarities and Differences between Drosophila and Human Telomeres},
volume = {3},
......
# Mode d'interaction de TRF2 avec l'ADN
Comme nous l'avons vu dans l'introduction, le mode d'interaction de TRF2 avec
l'ADN est complexe et ses propriétés ne s'expliquent pas uniquement par la
liaison du domaine Myb à l'ADN. Notamment, une expérience d'empreinte protéique
par acétylation des lysines réalisée par nos collaborateurs au laboratoire
d'Eric Gilson montre que beaucoup de régions de TRF2 sont engagées dans
l'interaction avec l'ADN (communication personnelle de Marie-Josèphe
Giraud-Panis). En particulier, quelques lysines situées dans le *linker* juste
en amont du domaine Myb semblent significativement protégées par la présence de
l'ADN. Nous avons donc produit une construction du domaine Myb allongée de 46
résidus en N-terminal (appelée Myb-long) et la construction classique
correspondant au domaine présent dans l'entrée PDB 1WOU (appelée Myb-court) afin
de comparer leurs modes d'interaction avec l'ADN. Pour cela nous avons utilisé
trois techniques : la calorimétrie de titration isotherme, le SAXS et
la cristallographie.
## Calorimétrie
La titration calorimétrique de ces deux constructions par un oligonucléotide
double-brin contenant deux sites TAGGG (T2-S5S7) montre des profils très
différents, ce qui suggère que la région du *linker* présente dans la
construction Myb-long participe bien à l'interaction avec l'ADN (figure
ci-dessous) :
![Figure : Titration calorimétrique des constructions Myb-court (à gauche) et Myb-long (à droite) par l'oligonuclétoide T2-S5S7.](resultats/figures/chap3/itc-mybs.png)
Du fait d'une grande incertitude sur la concentration du lot d'oligonucléotide
utilisé pour cette expérience, nous n'avons pas pu calculer les constantes
d'équilibre de dissociation de façon fiable. Ces titrations seront reproduites
très prochainement avec un lot d'oligonucléotide précisément dosé.
## SAXS
Nous avons également réalisé des mesures de SEC-SAXS sur ces deux complexes,
cette fois avec l'oligonucléotide T2-S5S8. Deux réplicats ont été mesurés sur
chaque complexe. Pour toutes les acquisitions le Rg est quasiment constant tout
le long du chromatogramme, ce qui montre la très bonne homogénéité des
échantillons (un des deux réplicats de chaque complexe est présenté dans la
figure ci-dessous) :
![Figure : Variation des paramètres Rg et I0 au cours de l'élution des complexes Myb-court/ADN (à gauche) et Myb-long/ADN (à droite).](resultats/figures/chap3/profils-rg-mybs.png)
Les courbes finales correspondant à ces acquisitions ont été obtenues en
calculant la moyenne des courbes 100 à 116 pour le complexe Myb-court/ADN
(courbe orange dans la figure ci-dessous), et la moyenne des courbes 60 à 76
pour le complexe Myb-long/ADN (courbe bleue foncée dans la figure ci-dessous).
Les courbes correspondant à l'autre réplicat (courbes rouge et bleu clair dans
la figure ci-dessous) ont été obtenues en calculant la moyenne des courbes dans
la même région du chromatogramme.
![Figure : Courbes de SAXS des complexes Myb-court/ADN (deux réplicats en rouge et orange) et Myb-long/ADN (deux réplicats en bleu foncé et clair).](resultats/figures/chap3/courbes-saxs-mybs.png)
L'analyse de Guinier donne un Rg d'environ 20 Å pour le complexe Myb-court/ADN
et d'environ 28 Å pour le complexe Myb-long/ADN. Cette différence de Rg de 8 Å
est clairement trop petite pour correspondre à 46 résidus supplémentaires
complètement désordonnés (qui représenteraient environ 80 Å de long dans une
conformation complètement étendue), ce qui suggère également que la portion de
*linker* du Myb-long interagit avec l'ADN.
QUE PEUT-ON CONCLURE AVEC LES P(r) ?
## Cristallographie
### Cristallogenèse
Afin de caractériser en détails le mode d'interaction avec l'ADN du Myb-long,
nous avons tenté de résoudre la structure cristallographique du complexe qu'il
forme avec l'ADN. Un premier crible de 7x 96 conditions de cristallisation
(certaines redondantes) a été réalisé à la plateforme de cristallogenèse de
l'Institut Pasteur (Paris) avec trois complexes différents basés sur les
oligonucléotides de 16 pb T2-S1S2, T2-S1S3 et T2-S1S4 (cf. Matériel et
méthodes). Après optimisation manuelle des meilleures conditions découvertes par
ce crible, la condition optimale suivante a été isolée :
- extrémités 3'-sortantes (oligonucléotide T2-S1S3),
- 17 °C
- CONDITION à RETROUVER
Cette condition n'a malheureusement produit que des cristaux irréguliers qui
diffractaient seulement à très basse résolution (environ 20 Å).
Il est connu que la cristallisation des complexes protéine/ADN est largement
affectée par la longueur et le type d'extrémités (donc par la séquence) de
l'oligonucléotide utilisé, et qu'il est plus raisonnable de cribler peu de
conditions avec plusieurs types d'oligonucléotides plutôt que de très nombreuses
conditions avec un seul oligonucléotide peu favorable [@hollis2007]. Nous avons
donc cherché à optimiser les oligonucléotides pour faire correspondre leur
longueur et leurs extrémités (nombre et nature des bases sortantes) à celles qui
sont le plus souvent observées dans les complexes protéine/ADN disponibles dans
la PDB [@hol2011; @brown1996]. Cette démarche nous a conduit à concevoir des
oligonucléotides de 20 pb avec une seule base sortante : T2-S5S6, T2-S5S7 et
T2-S5S8 (cf. Matériel et méthodes).
Afin de tester uniquement l'effet de l'oligonucléotide dans un premier temps,
nous avons commencé par tester la meilleure condition dont nous disposions alors
(détaillée ci-dessus) avec ces nouveaux oligonucléotides. Ceci nous a confirmé
que les cristaux les plus réguliers se forment avec l'oligonucléotide comportant
des extrémités sortantes en 3' (T2-S5S7), et à 17 °C, mais le pouvoir de
diffraction de ces cristaux n'était pas amélioré. Nous avons donc réalisé un
nouveau crible plus restreint de 2x 48 conditions avec uniquement
l'oligonucléotide T2-S5S7 et à 17 °C, en utilisant les conditions décrites dans
[@pryor2012; @lebihan2013]. Une seule condition, la n° 48 de [@pryor2012],
a permis d'obtenir des cristaux, mais à l'apparence meilleure que les précédents
et de façon bien reproductible : CONDITION. L'apparence typique de ces cristaux
est montrée dans la photo ci-dessous :
![Figure : Cristaux du complexe Myb-long/T2-S5S7.](resultats/figures/chap3/cristaux.jpg)
### Collecte et traitement des données
Ces derniers cristaux nous ont permis d'obtenir plusieurs jeux de données à des
résolutions allant de 1,8 à 2,2 Å de résolution, tous du groupe d'espace
P 1 21 1. Ces jeux de données sont présentés dans le tableau ci-dessous, avec
les statistiques de traitement des données :
Table: Tableau : Jeux de données cristallographiques et statistiques de
traitement des données.
-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
Cristal Maille (a, b, c Å et α, β, γ °) Résolution (Å) Nombre de réflexions Complétude (%) Rmeas (%) CC1/2 (%)
--------- --------------------------------- ------------------------------ ---------------------- ---------------- -------------- -------------
Myb2 87.87 27.21 108.74 90 98.29 90 49.024 – 2.146 (2.28 – 2.15) 28718 99.49 8.5 (96.9) 99.9 (67.7)
Myb9 89.23 28.43 110.6 90 99.5 90 44.003 – 1.991 (2.12 – 2.00) 38419 99.35 6.5 (119.1) 99.9 (81.6)
Myb10 89.12 28.47 110.44 90 99.42 90 43.959 – 2.093 (2.22 – 2.09) 32274 96.79 9.9 (108.8) 99.9 (70.0)
Myb31 89.07 28.22 110.71 90 99.49 90 43.926 – 2.198 (2.33 – 2.20) 28222 98.60 12.8 (154.7) 99.7 (53.2)
Myb32 89.0 28.37 110.62 90 99.479 90 43.89 – 1.789 (1.91 – 1.80) 52467 99.44 5.9 (176.7) 99.9 (63.0)
Myb34 89.16 28.45 110.42 90 99.36 90 43.986 – 1.788 (1.90 – 1.79) 51069 96.42 5.3 (116.4) 99.8 (54.3)
-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
### Résolution de la structure et affinement
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