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partie-3/resultats : manips ITC refaites proprement et interprétées

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### Calorimétrie
La titration calorimétrique des deux constructions Myb-court et Myb-long par
Les titrations calorimétriques des deux constructions Myb-court et Myb-long par
l'oligonucléotide double-brin T2-S5S7 (voir Matériel et méthodes) contenant deux
sites TAGGG montre des profils très différents (figure suivante) :
![Figure : Titration calorimétrique des constructions Myb-court (à gauche) et Myb-long (à droite) par l'oligonuclétoide T2-S5S7.](partie-3/figures/itc-mybs.png)
Du fait d'une grande incertitude sur la concentration du lot d'oligonucléotide
utilisé pour cette expérience, nous n'avons pas pu calculer les constantes
d'équilibre de dissociation de façon fiable. Le thermogramme de la titration du
Myb-court contient aussi des artéfacts de dilution probablement dus à une
différence de composition entre le tampon de la seringue et celui de la cuve.
Ces titrations seront reproduites très prochainement avec un lot
d'oligonucléotide précisément dosé.
Il est toutefois intéressant de noter que les thermogrammes montrent des pics
positifs dans le cas du Myb-court (la variation d'enthalpie ΔH est positive,
l'interaction est donc endothermique) et des pics négatifs dans le cas du
Myb-long (ΔH est négative, l'interaction est donc exothermique).
Cette différence témoigne d'un mode de liaison différent et suggère que la
région du *linker* présente dans la construction Myb-long participe bien
à l'interaction avec l'ADN.
sites TAGGG sont présentées dans la figure suivante :
![Figure : Titrations calorimétriques des constructions Myb-court (à gauche) et Myb-long (à droite) par l'oligonuclétoide T2-S5S7.](partie-3/figures/itc-mybs.png)
Les paramètres thermodynamiques obtenus sont résumés dans le tableau suivant :
Table: Tableau : Comparaison des paramètres thermodynamiques des interactions
Myb-court/ADN et Myb-long/ADN.
**Paramètre** **Myb-court/ADN** **Myb-long/ADN**
----------------- ------------------ -----------------
N 0,496 0,420
K~D~ (µM) 0,45 2,47
ΔG (cal/mol) -8221,5 -7248,92
ΔH (cal/mol) -5816 -8596
-TΔS (cal/mol) -2405,5 1347,08
Puisque l'oligonucléotide à deux sites se trouve dans la seringue et qu'une
molécule d'oligonucléotide se lie à deux molécules de protéine présentes dans la
cuve, la stoechiométrie attendue pour l'interaction est de 0,5 (1 ligand pour
2 récepteurs, soit 0,5 ligand par récepteur). Le paramètre N déterminé par
l'analyse du thermogramme représente la stoechiométrie à condition que les
concentrations des deux molécules soient précisément déterminées, et à condition
que chacune des deux molécules soit active à 100 %. Le paramètre N peut être
calculé par la formule suivante [@milev2015] :
$N = S \times \frac{FA_{cuve}}{FA_{seringue}}$
où S est la stoechiométrie et FA la fraction active telle que
$FA = \frac{[molécule]_{active}}{[molécule]_{totale}}$
Nous pouvons raisonnablement faire l'hypothèse que l'oligonucléotide est actif
à 100 % car nous avons vérifié son hybridation correcte. La valeur de
N inférieure à 0,5 est par conséquent probablement attribuable à une fraction
active de protéine inférieure à 100 %, ce qui est vraisemblable étant donné
qu'il est en pratique impossible de purifier parfaitement une protéine.
La formule précédente donne des fractions actives de 99,2 % et 84 % pour
Myb-court et Myb-long, respectivement.
Les affinités de Myb-court et Myb-long pour l'ADN sont du même ordre de
grandeur, dans la gamme micromolaire basse. Cependant la comparaison des
paramètres thermodynamiques ΔG (variation d'enthalpie libre), ΔH (variation
d'enthalpie) et ΔS (variation d'entropie) renseigne sur le mode de liaison.
ΔG est négatif pour une interaction favorable, il est directement lié à la
constante d'équilibre de dissociation par la relation ΔG = -RT ln K~D~ (R =
1,987 cal.K^-1^.mol^-1^ est la constante des gaz parfaits, T est la température
de l'expérience en K). D'autre part, ΔH et ΔS contribuent à ΔG selon la relation
ΔG = ΔH - TΔS. Ainsi, une variation d'enthalpie libre favorable à l'interaction
(donc négative) nécessite une contribution enthalpique (ΔH) négative et une
contribution entropique (ΔS) positive. Les valeurs des paramètres ΔG, ΔH et -TΔS
des deux interactions étudiées sont représentées graphiquement dans la figure
suivante :
![Figure : Comparaison des contributions enthalpique et entropique dans les interactions Myb-court/ADN et Myb-long/ADN.](partie-3/figures/parametres-thermo-mybs.png)
La contribution enthalpique (ΔH) est principalement due aux liaisons hydrogène
établies et rompues au cours de l'interaction (une valeur négative de ΔH indique
que des liaisons ont été établies). Nous observons que la contribution
enthalpique est plus favorable pour Myb-long que pour Myb-court (d'un facteur
environ 1,5), ce qui signifie que Myb-long établit plus de liaisons hydrogène
avec l'ADN. Cette observation est en accord avec les résultats de l'expérience
d'empreinte de nos collaborateurs.
La contribution entropique (ΔS) représente les changements de solvatation et de
conformation. Notamment, ΔS est négatif (la contribution à ΔG est donc
défavorable) lorsqu'une partie de la chaîne protéique perd des degrés de liberté
conformationnelle au cours de l'interaction. La contribution entropique est
défavorable pour Myb-long, comparé à Myb-court. Nous pouvons en déduire que la
portion de *linker* (résidus 400 à 445) adopte probablement une conformation
plus contrainte dans le complexe avec l'ADN, comparé à celle qu'elle adopte dans
la forme libre de la protéine. Ceci est également en accord avec l'hypothèse de
l'implication de cette région de TRF2 dans l'interaction avec l'ADN.
Il résulte de ces différentes contributions enthalpique et entropique que la
variation d'enthalpie libre de l'interaction Myb-long/ADN est presque égale
à celle de l'interaction Myb-court/ADN (cette dernière est plus favorable d'un
facteur environ 1,1), ce qui explique le même ordre de grandeur des constantes
d'équilibre de dissociation correspondantes.
### SAXS
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......@@ -1773,6 +1773,17 @@ Database {URL:} {TeloPIN} database address is http://songyanglab.sysu.edu.cn/tel
pages = {785{\textendash}815}
},
@misc{milev2015,
title = {Don't throw away your "bad" N-value {ITC} data},
url = {http://www.materials-talks.com/blog/2015/04/23/dont-throw-away-your-bad-n-value-itc-data/},
abstract = {It is important to understand that the {ITC} N{\textendash}value is not the same thing as the stoichiometry (binding ratio). N-value does in fact equal the stoichiometry if the concentrations we use for the fitting are correct and 100\% active.},
author = {Milev, Stoyan},
month = apr,
year = {2015},
note = {00000},
keywords = {citation-these, Data analysis, {ITC}}
}
@article{mitchell2010,
title = {Structural basis for telomerase catalytic subunit {TERT} binding to {RNA} template and telomeric {DNA}},
volume = {17},
......
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